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DOTMA在脂質體轉染實驗中的實驗步驟淺析

更新時間:2021-08-06   點擊次數:1097次

本篇文章AVT來介紹一下DOTMA在脂質體轉染實驗中的實驗步驟。



脂質體轉染實驗步驟


脂質體(LR)試劑是陽離子脂質體DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中,是目前條件下方面的轉染方法之轉染率高,優于磷酸鈣法,比它高5-100倍,能把DNA和RNA轉染到各種細胞。用LR進行轉染時,首先需要優化轉染條件,應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等,對每批LR都要做,先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間,DNA可從1-5ug和孵育時間6h,開始按這兩個參數繪出相應LR需用量的曲線,再選用LR和DNA兩者的劑量,確定出轉染時間,因LR對細胞有一定的毒性,轉染時間以不超過24h為宜。

 細胞種類:C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。


 1、操作步驟(方法一)

 1)取6孔培養板,向每孔中加入2m1含(1-2)x105個細胞的培養基,37℃、18%C02培養基40%-60%匯合時。

 2)轉染液制備:在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉染1個空細胞所用的A液:用不含血清培養基稀釋DNA使濃度為1-10ug,終量100u1。B液:用不含血清培養基稀釋LR,使終濃度為2-50ug,終量100u1輕輕混合A液、B液,室溫中置10-15min,稍后會岀現微濁現象,但并不妨礙轉染

 3)轉染準備:用2m1不含血清培養基漂洗2次,再加入1m1不含血清培養基

 4)轉染:把AB復合物緩緩加入培養基中,搖勻,置37℃溫箱中6-24h吸除無血清轉染液,換入正常培養基繼續培養

 5)其余處理:如觀察、篩選、檢測等與其他轉染法相同

 6)注意:轉染時切勿加血清,血清對轉染效率有很大影響。


 2、快速脂質體轉染法操作步驟(方法二)

 ●……將細胞以5x105個/孔接種于6孔板中培養24h,使其達到50%-60%板底面積。

 ●……在試管中配制DNA-脂質體復合物

a、在1m1無血清DMEM中稀釋PSV1-neo質粒DNA或供體DNAb、旋轉1s,再加入脂質體懸液,旋轉。

c、室溫下放置5-10min,使DNA結合在脂質體上。

 ●……棄去細胞中的舊液,用1m1無血清DMEM洗細胞1次后棄去,向每孔中直接加入1m1DNA-脂質體復合物,37℃培養3-5天再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,繼續培養14-24h。吸出DEM-DNA-脂質體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,2m1/L,再培養24-48h。用細胞刮或消化法收集細胞,以備分析鑒定


 3、穩定的脂質體轉染法

 ●……接種細胞同前述,細胞長至50%

 ●……DNA-脂質體復合物制備轉染細胞同前。

 ●……在每孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,37℃培養48h。

 ●……吸出DEM,用G418選擇性培養基稀釋細胞,使細胞生長一定時間篩選轉染克隆,方法參照細胞克隆篩選法進行。



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